菌落总数测试片检测方法

方法编号：5011

1 原理及适用范围：菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后所得1mL(g)检样或单位面积样品中所含菌落形成单位(colony-forming units,CFU)，是最常用的检测项目指标。菌落总数测试片（Aerobic Count Plates）是一种预先制备好的一次性培养基产品，含有标准的营养培养基，冷水可溶性的吸水凝胶和脱氢酶指示剂——氯化三苯基四氮唑（TTC），菌落在测试片上呈紫红色或粉红色，这样可缩短计数时间和增强计数效果。本产品适合于食品及水中菌落总数的测定，也可用于与食品接触的容器操作台和其他设备表面的卫生检测。

2 样品处理与稀释

2.1 生活饮用水：取充分混匀的水样（原液）检测。

2.2 水源水：以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀成1:10稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇后成为1:100的稀释液，以此类推，做出1:1000等稀释度的稀释液，每次换一支吸管。

2.3 食品：取样品 25 mL（g）放入含有225 mL灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内，充分混匀成1:10稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇后成为1:100的稀释液，以此类推，做出1:1000等稀释度的稀释液，每次换一支吸管。

3 接种：将菌落总数测试片置于实验台面，揭开上层膜准备接种。生活饮用水、纯水和矿泉水取原液，每个样品做两片；水源水以及食品选择2～3个稀释度进行检测，每个稀释度同时应做一平行接种。以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL混匀的样品液，慢慢均匀地滴加到测试片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置5 min使培养基凝固，最后用手轻轻地压一下。每次检测，同时将1mL灭菌生理盐水滴加到另一片测试片上作为空白对照。

4 培养： 将测试片叠在一起放回原自封袋中，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过10片。培养温度为36℃±1℃，培养15～24h观察结果。

5 结果判读: 细菌在测试片上生长后会显示红色***，选择菌落数适中（30～300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（克）样品中所含的菌落总数(CFU/mL或CFU/g)。作菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。低于30 CFU的测试片记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个测试片的平均数。

6 计数原则及报告方式

6.1  若只有一个稀释度纸片上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个纸片菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每毫升(或克)样品中菌落总数结果（见实例1）。

6.2  若有两个连续稀释度的纸片菌落数在适宜计数范围内时（见实例2），按以下公式计算:

······························（1）

   式中：

    N——样品中菌落数；

    ∑C——测试片上(含适宜范围菌落数的测试片)菌落数之和；

    n₁——***个适宜稀释度测试片数；

    n₂——***个适宜稀释度测试片数；

  d——稀释因子(***稀释度)。

上述数据经“四舍五入”后，表示25000或2.5×10⁴。

6.3  若所有的稀释度菌落总数均大于300 CFU，则对稀释度的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以稀释倍数计算（见实例3）。

6.4  若所有的稀释度菌落总数均小于30 CFU，则应按稀释度***的平均菌落数乘以稀释倍数计算（见实例4）。

6.5 若所有的稀释度（包括液体样品原液）均无菌落生长，则以小于1乘以***稀释倍数计算（见实例5）。

6.6  若所有稀释度的平均菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算（见实例6）。

6.7 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

6.8称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

表1  稀释度选择及菌落总数报告方式

7 表面取样方法：加1mL灭菌生理盐水在测试片上，静置至少1h使培养基凝固；提起上层膜，使中央滤纸部分贴到待测物表面，用手在外侧轻压；然后将上盖膜合上，置培养箱内培养。